Descrizione:

 

Per ulteriori informazioni sul Centro di Ricerca Matilde Tettamanti cliccare il seguente link: https://fondazionetettamanti.it

I Laboratori di ricerca della Fondazione Tettamanti sono parte integrante dell’IRCCS San Gerardo sia come spazi di Laboratorio (circa 1200 mq siti al piano terra del Centro M.L.Verga) che per le avanzate attrezzature e personale attraverso apposita piattaforma di convenzione tra IRCCS San Gerardo e Fondazione Tettamanti.

Le attività di ricerca sono articolate secondo le seguenti aree:

 

Genetica della leucemia (PI Prof. Giovanni Cazzaniga: giovanni.cazzaniga@irccs-sangerardo.it)

L’attività di ricerca riguarda la comprensione dei meccanismi patogenetici della Leucemia Acuta Linfoblastica (LAL), il tumore più frequente in età pediatrica:

1. Caratterizzazione e bersaglio terapeutico di sottogruppi di LAL pediatrica ad alto rischio

Obiettivo di caratterizzare funzionalmente gli eventi patogenetici di specifici sottogruppi di LAL pediatrica associati ad un alto rischio di recidiva della malattia, al fine di trovare nuovi farmaci specifici per una terapia mirata personalizzata.

2. Caratterizzazione della fase pre-leucemica della LAL del bambino

La traslocazione t(12;21) è un’alterazione genetica che genera il gene di fusione ETV6:RUNX1 e avviene nei precursori dei linfociti del bambino prima della nascita, durante il suo sviluppo nell’utero materno e costituisce l’evento iniziale necessario, ma insufficiente, per la manifestazione della LAL. Per la comparsa clinica della malattia sono infatti necessarie ulteriori mutazioni che possono insorgere in alcuni bambini con questa anomalia, da pochi mesi fino anche a 15 anni dopo la nascita (“fase pre-leucemica”). Scopo del progetto è comprendere quali siano gli stimoli successivi alla nascita che, in presenza del gene di fusione ETV6::RUNX1, possano creare ulteriori danni e dare vantaggi selettivi alla cellula contribuendo all’insorgenza della leucemia.

3. Predisposizione genetica a LAL pediatrica

E’ sempre più evidente che la LAL pediatrica ha un'origine multifattoriale, in cui un ruolo emergente è occupato dalla suscettibilità genetica individuale. È stato infatti dimostrato che alcune condizioni genetiche predispongano allo sviluppo di LAL. Si vogliono indagare famiglie con elevato sospetto di familiarità a leucemie e tumori per identificare nuove varianti geniche associate a predisposizione a LAL, oltre che predisporre percorsi di sorveglianza terapeutica e preventiva in pazienti con comprovata predisposizione genetica.

Inoltre:

4. Analisi di alterazioni genetiche in pazienti pediatrici con immunodeficienze

Collaborazione con l’ambulatorio di Immunologia della Clinica Pediatrica per l’identificazione di alterazioni genetiche costitutive e caratterizzazione funzionale del danno cellulare in pazienti con immunodeficienza con sospetto di base genetica.

 

Citometria e Terapia Molecolare (PI Dr.Giuseppe Gaipa: giuseppe.gaipa@irccs-sangerardo.it)

L’attività di ricerca riguarda la comprensione dei meccanismi di chemio-resistenza della Leucemia Acuta Linfoblastica (LAL) anche attraverso il monitoraggio della malattia residua minima e lo studio del signaling intracellulare, la prevenzione dell'evasione immunitaria e delle ricadute post-trattamento con cellule CAR T, lo studio dell’immunoricostituzione dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche nella LAL.

1. Strategie multi targeting con cellule CAR-T nella LAL a cellule B:

Il trasferimento adottivo di cellule CAR ha rivoluzionato il trattamento della LAL tuttavia dopo i primi risultati promettenti, sono emerse alcune criticità come l'insorgenza di recidive negative per CD19 (antigene bersaglio del CAR). Per superare i limiti del metodo virale nell'ingegneria delle cellule T, il nostro gruppo ha sviluppato cellule CIK (Cytokine Induced Killer) ingegnerizzate con CAR anti-CD19 attraverso una piattaforma basata su trasposon Sleeping-Beauty (SB) (CARCIK-CD19) (Magnani CF et al, JCI, 2020). Lo scopo del progetto è quello di sviluppare cellule CAR anti-CD22 e anti-BAFFR da utilizzare in pazienti resistenti alle cellule CAR T anti-CD19, in una strategia multi-targeting. Nel contesto delle neoplasie ematologiche a cellule B mature (ad es. Linfomi non-Hodgkin) l’antigene CD79b è stato dimostrato essere altamente espresso sia al momento della diagnosi che della recidiva. L'obiettivo è sviluppare cellule CARCIK anti-CD79b di quarta generazione con la capacità di secernere in situ citochine stimolanti l’azione e la persistenza delle cellule CAR.

2. Ruolo del microambiente nella attività biologica dei linfociti CARCIK-CD19

Una migliore comprensione dei fattori biologici che possono influenzare l’efficacia e la durata dell’azione dei linfociti CAR T in vivo è uno degli approcci piu’ promettenti per il miglioramento del successo terapeutico delle CAR-T. Uno dei principali obiettivi del progetto o si basa sulla caratterizzazione del profilo di espressione genica a livello di singola cellula (e successiva validazione in vitro ed in vivo) all’interno del microambiente tumorale, al fine di identificare i meccanismi di evasione immunitaria all’interno della nicchia leucemica midollare.

3. LAL-T pediatrica ad alto rischio: studio dei meccanismi di resistenza alla chemioterapia

La leucemia linfoblastica acuta a cellule T (LAL-T) è una neoplasia ematologica derivante dalla trasformazione e dall'espansione clonale dei precursori delle cellule T. Nonostante i recenti progressi nel trattamento, la chemioresistenza rimane una delle principali cause di recidiva della malattia che in circa il 30% dei casi è a prognosi infausta. Per questo motivo sono necessarie nuove conoscenze sulla biologia della LAL-T e sui determinanti molecolari della sua risposta al trattamento. Noi Ipotizziamo che la LAL-T presenti una eterogeneità nei meccanismi di risposta ai farmaci a causa del complesso sistema di alterazioni genetiche e vie di segnalazione implicate nella sopravvivenza e nella proliferazione cellulare. Lo scopo dello studio è quello di studiare l'eterogeneità della risposta della LAL-T ai farmaci mediante approcci di citometria di massa sia alla diagnosi che nelle cellule di malattia residua minima. Inoltre vogliamo definire un modello matematico che ricostruisca in silico la rete biomolecolare responsabile dell'apoptosi mediata dai farmaci ed infine identificare obiettivi molecolari da inibire in combinazione con il trattamento farmacologico.

4. Studio dell’immunoricostituzione immunologica dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche nella LAL.

Una ricostituzione immunitaria efficace e rapida post-trapianto di cellule staminali emopoietiche (IR post-HSCT) ha un impatto decisivo sull’esito clinico dei pazienti sottoposti a questo trattamento. Attualmente, la pratica clinica si basa essenzialmente sulla conta delle cellule T CD4+. Inoltre, dopo il trapianto possono verificarsi complicazioni quali infezioni batteriche o fungine, malattia del trapianto contro l'ospite (GvHD, acuta o cronica) e recidiva di malattia nel caso delle leucemie. In tutte queste situazioni il sistema immunitario svolge un ruolo fondamentale che ad oggi non è ancora del tutto esplorato. Pertanto una valutazione sistematica e standardizzata dell’IR post-HSCT in una coorte di pazienti con LAL sufficientemente ampia ed omogenea farebbe luce sul meccanismo alla base di queste complicanze. Ciò si potrà tradurre in nuovi strumenti a disposizione dei clinici per guidare la gestione dei pazienti trapiantati. Lo scopo dello studio è quello di Sviluppare un pannello di anticorpi monoclonali per valutare l'IR post-HSCT mediante citometria a flusso di ultima generazione (citometria spettrale) nell’ambito del consorzio EuroFlow. In questo contesto valuteremo inoltre la ricostituzione dei recent thymic emigrants (RTE), una sottopopolazione di linfociti CD4 naive che emergono dal timo, hanno limitato potenziale proliferativo, e costituiscono una misura diretta dell’attività del timo.

 

Cellule staminali e immunoterapia (PI Prof.ssa Marta Serafini: marta.serafini@unimib.it)

La principale attività di ricerca riguarda l’elucidazione delle alterazioni indotte dalla leucemia mieloide acuta al microambiente midollare dove si annidano le cellule staminali leucemiche, lo sviluppo di terapie efficaci, basate sulla tecnologia Chimeric Antigen Receptor T-cells (CAR-T cells), per colpire queste cellule all’interno del midollo osseo, sperimentando marcatori specifici e studiando strategie per aiutare le cellule CAR così ingegnerizzate ad indirizzarsi in maniera ancora più mirata contro i blasti annidati all’interno della nicchia leucemica.

1.Nicchia patologica di cellule staminali ematopoietiche nella leucemia mieloide acuta

Studio di specifici meccanismi coinvolti nella complessità della nicchia patologica della leucemia mieloide acuta. Per evidenziare alterazioni intrinseche nel potenziale di differenziazione delle cellule staminali mesenchimali derivate da pazienti si utilizzano modelli raffinati di organoidi che mimano le peculiarità del midollo osseo e modelli di xenotrapianto specifici per studiare le proprietà del microambiente alterato in condizioni patologiche.

2. Approcci di targeting della nicchia midollare modificata dalla leucemia mieloide acuta

Targeting della nicchia leucemica con una piattaforma basata su cellule CAR. In particolare, si stanno studiando meccanismi e strategie per implementare una piattaforma basata su cellule CAR-CIK, in modo da indirizzare la terapia in maniera ancora più mirata contro le cellule staminali leucemiche e per interferire nella interazione fra blasti leucemici e cellule mesenchimali stromali (cellule che possono inficiare l’efficacia della terapia tramite un effetto immunosoppressorio) e per ridurre gli effetti indesiderati sui tessuti sani.

3. Sviluppo di cellule CAR-CIK per eradicare le cellule staminali leucemiche presenti nel midollo osseo dei pazienti affetti da leucemia mieloide acuta

Nel tradurre la terapia con cellule CAR-CIK nel contesto della leucemia mieloide acuta, un ostacolo rilevante è rappresentato dalla mancanza di un antigene bersaglio appropriato, che sia espresso selettivamente solo sulle cellule staminali leucemiche. Al fine di migliorare la selettività verso questa sottopopolazione di cellule maligne resistenti e, allo stesso tempo, ridurre la tossicità, si stanno sviluppando cellule CAR-CIK che vadano a colpire con efficacia le cellule staminali leucemiche, evitando l'effetto tossico, definito “off-target”, su tessuti normali, come cellule staminali ematopoietiche e cellule endoteliali sane.

Un altro interesse dell’unità, riguarda lo studio di una malattia genetica rara malattia con esordio in età pediatrica, la mucopolisaccaridosi di tipo I. Sono in corso progetti volti ad implementare approcci di terapia cellulare e genica in epoca neonatale, per prevenire il decorso della malattia. In parallelo, si sta approfondendo la comprensione dei meccanismi alla base del difetto scheletrico che in questa patologia è particolarmente severo.

4.Trapianto neonatale nella mucopolisaccaridosi di tipo I (sindrome di Hurler)

L’interesse di ricerca si è concentrato anche su una malattia genetica rara, la sindrome di Hurler, esplorando la possibilità di un nuovo approccio terapeutico basato sul trapianto neonatale di cellule staminali emopoietiche. I dati ottenuti hanno portato a pubblicazioni che descrivono per la prima volta un approccio efficace per prevenire il difetto scheletrico caratteristico di questa malattia. Alcuni studi sono stati rivolti ad una ottimizzazione della modellistica in vivo del trapianto di cellule staminali ematopoietiche ottenute da diverse fonti biologiche in epoca perinatale. L’interesse attuale è rivolto alla possibilità di combinare la terapia neonatale con approcci di terapia genica virale e non.

5. Delucidazione del meccanismo d’azione del difetto scheletrico nella sindrome di Hurler: sviluppo di un organoide del midollo osseo

Gli studi sulla sindrome di Hurler sono focalizzati sul danno scheletrico tipico di questa condizione al fine di elucidarne il meccanismo sconosciuto. Con l'obiettivo finale di elucidare il processo di ossificazione endocondrale tipico di questo difetto, è stato sviluppato un nuovo modello in vivo (organoide umanizzato), che riproduce con alta fedeltà l'architettura dell’osso, del midollo osseo e del microambiente midollare.

 

Immunologia e Terapia cellulare (PI Dr.ssa Giovanna D’Amico: giovanna.damico@irccs-sangerardo.it)

L’attività di ricerca si basa su diversi linee di ricerca riguardanti lo studio della nicchia di BCP-ALL, per identificare i segnali derivati dallo stroma midollare che guidano il mantenimento, l'evoluzione nonché la chemioprotezione della leucemia, al fine di scoprire nuovi bersagli terapeutici. Un focus specifico è dato ad ActivinA, un modulatore chiave del mantenimento e dell'aggressività della leucemia.

1. Studio della nicchia di BCP-ALL

In particolare stiamo analizzando l’effetto di ActivinA su diversi meccanismi biologici alla base del cross-talk tra leucemia e stroma midollare. Uno di questi meccanismi alla base della comunicazione tra leucemia e stroma è dato dalla produzione di vescicole extracellulari contenenti proteine, acidi nucleici e metaboliti che sono in grado di modulare le attività cellulari. Stiamo analizzandol’effetto di ActivinA sulla vescicolazione cellulare di BCP-ALL; in termini di concentrazione di proteine. In particolare abbiamo determinato che linee leucemiche sono in grado di produrre EV, ma l'aggiunta di Activin A aumenta significativamente il rilascio di tali vescicole, modificandone inoltre il loro contenuto.

Inoltre stiamo indagando i meccanismi alla base della protezione metabolica delle cellule leucemiche operata dalle cellule mesenchimali stromali (MSC), mediante l'identificazione delle vie metaboliche proleucemiche, con un approccio di metabolomica e di caratterizzazione degli effetti di ActivinA sul metabolismo delle MSC e delle cellule leucemiche.

Un’altra linea di ricerca si basa sullo studio del coinvolgimento della matrice extracellulare nella sopravvivenza e chemioprotezione della leucemia nella nicchia leucemica, mediate studi di proteomica della matrice extracelluare prodotta dalle MSC leucemiche o stimolate con ActivinA

2) Targeting molecolare e/o cellulare della nicchia midollare della BCP-ALL

A) Sequestro di ActivinA dal microambiente leucemico mediante un farmaco trappola

Il targeting della nicchia midollare leucemica mediante il sequestro farmacologico di AttivinaA potrebbe essere una strategia promettente per migliorare i tassi di cura dei pazienti pediatrici con LLA-B, refrattari alla chemioterapia tradizionale. Abbiamo quindi messo a punto un modello di leucemia umana in topi immunodeficienti ed abbiamo dimostrato come i livelli di AttivinA nel sangue sono risultati direttamente correlati con la percentuale di cellule leucemiche infiltranti il midollo. L’effetto del farmaco trappola di ActivinA è in corso e viene analizzato, mediante analisi della sopravvivenza, studi di immunoistochimica, citofluorimetria e single cell RNA sequencing.

B) Targeting della componente macrofagica protumorale nella nicchia leucemica

La BCP-ALL riprogramma lo stroma del midollo osseo circostante per creare nicchie di supporto alla leucemia. Per chiarire il contributo delle cellule immunitarie al microambiente leucemico, abbiamo studiato il coinvolgimento dei compartimenti dei monociti e dei macrofagi nella BCP-ALL. Abbiamo dimostrato che i macrofagi presenti nella nicchia leucemica presentano prevalentemente i marcatori dei macrofagi M2 pro-tumorali, partendo da tali dati stiamo generando recettori chimerici per armare le cellule CIK: le CARCIK-CD19 colpiranno quindi direttamente la cellula leucemica e, con un secondo CAR, il macrofago pro-tumorale che non sarà più in grado di “proteggere” le cellule leucemiche che rimarranno eventualmente presenti.

Parallelamente, mediante l’utilizzo di composti lipidici specifici, stiamo valutando la possibilità di redirezionare i macrofagi M2 ad attività pro-tumorale in macrofagi M1 ad attività anti-tumorale in modo che esercitino la loro funzione anti-leucemica direttamente a livello della nicchia midollare.

3- Caratterizzazione delle cellule staminali mesenchimali (MSC) ottenute dai pazienti con sindrome Schwachman-Diamond

La sindrome di “Schwachman-Diamond” (SDS) è una malattia rara ereditaria caratterizzata da insufficienza del pancreas esocrino e da alterazioni ematologiche legate a disfunzione midollare, caratterizzata principalmente da una neutropenia costante o intermittente, meno frequentemente da una piastrinopenia e un'anemia; più raramente sono presenti mielodisplasia e leucemia. Inoltre, studi condotti nel nostro laboratorio sia in vivochein vitro, mostrano come le MSC ottenute da pazienti SDS (SDS-MSC) non sono in grado di formare vasi funzionanti.

Le attività di ricerca si sono quindi focalizzate su due progetti:

A- caratterizzare il metabolismo delle SDS-MSC

È noto come un’angiogenesi patologica sia spesso accompagnata da alterazioni metaboliche. Stiamo analizzando la fosforilazione ossidativa, la produzione di radicali dell’ossigeno (ROS) e marcatori del danno ossidativo nelle SDS-MSC. Abbiamo dimostrato una drastica alterazione del metabolismo ossidativo che causa un accumulo di ROS che potrebbe spiegare l’incapacità di queste cellule di intervenire correttamente nei processi di angiogenesi.

B- studio dell’effetto di antiossidanti sul metabolismo delle SDS-MSC.

Al fine di ripristinare il corretto metabolismo nelle SDS-MSC abbiamo deciso di utilizzare molecole ad attività anti-ossidante. Risultati preliminari mostrano come questi siano grado di ripristinare il metabolismo nelle SDS-

MSC. Inoltre dati ottenuti in collaborazione con la Prof. Reminucci dell’Università la Sapienza di Roma, è emerso che le SDS-MSC non sono in grado di generare vasi funzionali in un modello murino specifico, rispetto alle MSC da donatori sani. Stiamo attualmente valutando l’effetto dell’infusione di farmaci ad attività anti-ossidante sulla capacità delle SDS-MSC di formare vasi in questo modello murino.